Разработан метод MYSTIC-seq для поиска места встройки трансгена в геноме
Чтобы найти место встройки трансгена, достаточно стандартного секвенирования коротких прочтений без специальных зондов. Метод дешевле подходов на длинных прочтениях и доступен геномным лабораториям.
Сотрудники Института цитологии и генетики (ИЦиГ) СО РАН предложили метод определения места встройки трансгена в геном. Он называется MYSTIC-seq. Метод работает на стандартном секвенировании коротких прочтений и не требует разработки специальных зондов. По словам авторов, он значительно дешевле подходов на длинных прочтениях, поэтому доступен лабораториям с компетенциями в геномике. Результаты опубликованы в журнале Transgenic Research.
При создании трансгенных животных конструкция чаще всего встраивается в практически случайный участок генома. От этого места зависит работа трансгена: окружающий хроматин может подавлять его экспрессию. Встраивание может сопровождаться делециями и другими перестройками, которые нарушают работу собственных генов организма. Определить место встройки непросто, потому что геном большой.
Знание координат трансгена нужно и в повседневной работе. Оно позволяет создать ПЦР-тест, который отличает гемизиготных, гомозиготных и диких, немодифицированных особей, и получать гомозиготные линии.
Главная особенность MYSTIC-seq в том, что библиотеку зондов для захвата нужных фрагментов ДНК получают прямо из плазмиды, которой создавали трансгенных животных. Обогащённые фрагменты секвенируют на платформе Illumina примерно при 1 миллионе прочтений на образец. Место встройки определяют по локальному росту покрытия генома рядом с точкой вставки и по прочтениям, которые захватывают границы трансгена и генома.
Метод проверили на трёх линиях трансгенных мышей, полученных пронуклеарной микроинъекцией. У линии ACE5 картировали обе границы соединения трансгена с геномом и нашли делецию около 54 т.п.н. Это позволило создать ПЦР-тест для определения зиготности и получить гомозиготную линию без дополнительных скрещиваний. У линий MT1 и APP определили по одной границе, и этого хватило для генотипирования.
Очень круто делать это длинными прочтениями, но получается дорого. Мы предлагаем более дешёвый вариант, который доступен геномным лабораториям.
Метод имеет ограничения. Для полной реконструкции локуса его можно дополнить секвенированием длинных прочтений. Для быстрого определения координат встройки при генотипировании, по оценке разработчиков, MYSTIC-seq достаточно. По словам Нариман Баттулина, метод применим к любой конструкции, для которой доступна исходная плазмида, а также для поиска мест встройки вирусов.
Комментарии
Пока никто не написал. Будьте первым.